1.本发明涉及水产加工技术领域，种甘质提作方尤其涉及一种甘油酯型鳗鱼脂质提取物的油酯鱼脂艺及应用提取工艺及应用。
背景技术：
2.鳗鱼因营养丰富，型鳗肉鲜质嫩，取物取工含有大量的提的制蛋白质、维生素、种甘质提作方不饱和脂肪酸等，油酯鱼脂艺及应用可以降低血液中胆固醇，型鳗促进大脑发育和预防心血管疾病，取物取工享有“水中人参”的提的制美誉，深受消费者喜爱。种甘质提作方
3.鳗鱼油富含不饱和脂肪酸，油酯鱼脂艺及应用目前，型鳗市面上最常用的取物取工ω-3脂肪酸的富集方法有尿素包合法与分子蒸馏法，尿素包合法有机试剂消耗量大，提的制容易造成环境污染。而分子蒸馏法采用高温容易破坏不饱和脂肪酸，并且主要适用于乙酯型油脂的富集，难以获得ω-3甘油酯型鳗鱼油提取物。相对乙酯型鱼油而言，甘油酯型鱼油更容易被人体吸收、不易氧化、安全性好，因此，亟需开发一种提取效果好、污染小的ω-3脂肪酸提取工艺。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种甘油酯型鳗鱼脂质提取物的提取工艺及应用，其工艺流程简单，鳗鱼脂质提取物中的dha和epa含量相比现有的鳗鱼油有明显提高，具有降血脂的功效。
5.为达到上述目的，本发明公开了一种甘油酯型鳗鱼脂质提取物的提取工艺，其包括以下步骤：
6.原料前处理：以鳗鱼下脚料为原料，将原料捣成肉糜，并脱除水分。
7.超临界萃取：将前处理后的原料进行co2超临界萃取，得到萃取液，再对萃取液进行分离，得到粗油脂。
8.酶法富集：通过脂肪酶将粗油脂水解，富集ω-3甘油酯即得鳗鱼脂质提取物。
9.其中，酶法富集步骤执行至少一次。
10.优选地，鳗鱼下脚料选用海鳗内脏；脂肪酶选用皱褶假丝酵母脂肪酶。
11.优选地，原料前处理步骤中，原料捣成肉糜后，在-15～-25℃温度下预冻12～36h，然后通过真空冷冻干燥机脱除水分，之后在-15～-25℃温度下贮存备用。
12.优选地，前处理后的原料先破碎后再进行co2超临界萃取，萃取温度为30～60℃，萃取压力为20～30mpa，萃取时间为1～3h。
13.优选地，co2超临界萃取时，萃取温度为40℃，萃取压力为25mpa，萃取时间为3h。
14.优选地，超临界萃取步骤通过ha220-40-11型的超临界提取装置实现；萃取液经过超临界提取装置的分离器时，分离器设定温度为37～55℃，设定压力为4.5～8mpa，待温度和压力达到设定值后，每间隔0.5～2h取油一次，直至取完为止，即得粗油脂。
15.优选地，萃取液经过超临界提取装置的分离器时，分离器设定温度为55℃，设定压力为8mpa，待温度和压力达到设定值后，每间隔1h取油一次，直至取完为止。
16.优选地，粗油脂水解时，取脂肪酶加入磷酸盐溶液中，再与粗油脂按照1～3：1比例混合均匀，其中，磷酸盐溶液的浓度为0.1～0.3mol/l，磷酸盐溶液ph＝5～7，脂肪酶相对粗油脂的添加量为300～500u/g；之后充氮密封，在30～50℃温度下搅拌反应2～6h；水解完成后，在水解产物中加入氢氧化钠-乙醇溶液调节ph至8.5～10.5，再加入正己烷萃取至有机相无色，加入无水硫酸钠去除水分，在30～50℃温度下蒸发有机溶剂，即得鳗鱼脂质提取物。
17.优选地，粗油脂水解时，加入脂肪酶的磷酸盐溶液与粗油脂按照2:1比例混合均匀，磷酸盐溶液的浓度为0.1mol/l，磷酸盐溶液ph＝6，脂肪酶相对粗油脂的添加量为400u/g；充氮密封后，在40℃温度下搅拌反应4h；水解完成后，在水解产物中加入氢氧化钠-乙醇溶液调节ph至9.5，再加入正己烷萃取至有机相无色，加入无水硫酸钠去除水分，在35℃温度下蒸发有机溶剂。
18.此外，本发明还公开了通过上述任一项所述的甘油酯型鳗鱼脂质提取物的提取工艺得到的鳗鱼脂质提取物在降血脂药物中的应用。
19.本发明具有以下有益效果：
20.本发明对鳗鱼下脚料先后进行超临界萃取和酶法富集处理，即可得到鳗鱼脂质提取物，工艺流程简单方便。通过本发明工艺得到的鳗鱼脂质提取物，其dha和epa含量相比现有工艺的提取物提高了一倍以上，同时还具有降脂和改善血管壁厚的功效。
附图说明
21.图1为斑马鱼尾部血管染色强度典型图(正常对照组)。
22.图2为斑马鱼尾部血管染色强度典型图(模型对照组)。
23.图3为斑马鱼尾部血管染色强度典型图(阳性对照组)。
24.图4为斑马鱼尾部血管染色强度典型图(250μg/ml试验组)。
25.图5为斑马鱼尾部血管染色强度典型图(500μg/ml试验组)。
26.图6为斑马鱼尾部血管染色强度典型图(1000μg/ml试验组)。
27.图7为斑马鱼尾部血管染色强度与模型比较图。
28.图8为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度典型图(正常对照组)。
29.图9为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度典型图(模型对照组)。
30.图10为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度典型图(阳性对照组)。
31.图11为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度典型图(250μg/ml试验组)。
32.图12为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度典型图(500μg/ml试验组)。
33.图13为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度典型图(1000μg/ml试验组)。
34.图14为斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度比较图。
35.图15为斑马鱼眼部血管典型图(正常对照组)。
36.图16为斑马鱼眼部血管典型图(模型对照组)。
37.图17为斑马鱼眼部血管典型图(阳性对照组)。
38.图18为斑马鱼眼部血管典型图(250μg/ml试验组)
39.图19为斑马鱼眼部血管典型图(500μg/ml试验组)。
40.图20为斑马鱼眼部血管典型图(1000μg/ml试验组)。
41.注1：图7和图14中，*表示p＜0.1，*表示p＜0.05，*表示p＜0.001。
42.注2：图16中箭头指向斑马鱼眼部血管壁。
具体实施方式
43.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
44.本发明公开了一种甘油酯型鳗鱼脂质提取物的提取工艺，其包括以下步骤：
45.1、原料前处理
46.以鳗鱼下脚料为原料，优先选用海鳗内脏。将原料放入匀浆机中匀浆成肉糜，再将肉糜放入冰箱中，在-20℃温度下预冻24h，肉糜预冻结束后用真空冷冻干燥机脱除水分，之后置于冰箱中在-20℃温度下贮存备用。
47.2、超临界萃取
48.超临界萃取具有萃取时间短、温度低、无毒害、不易燃、低成本、清洁环保等优点，是有效替换有机溶剂萃取的方式。本步骤通过ha220-40-11型的超临界提取装置实现，将前处理后的原料进行co2超临界萃取，得到萃取液，再对萃取液进行分离，得到粗油脂。
49.先对冻干的肉糜进行机械破碎，然后加入萃取釜中，锁紧压帽，进行co2超临界萃取，萃取温度为30～60℃，萃取压力为20～30mpa，萃取时间为1～3h，加入co2流体可得萃取液。
50.萃取液经过超临界提取装置的分离器时，分离器设定温度为55℃，设定压力为8mpa，待温度和压力达到设定值后，每间隔1h取油一次，直至取完为止，即得粗油脂。
51.co2在本发明工艺中可以循环使用。通过称量粗油脂的质量，可以计算出得率。
52.3、酶法富集
53.通过脂肪酶将粗油脂水解，富集ω-3甘油酯即得鳗鱼脂质提取物，酶法富集步骤执行至少一次。利用脂肪酶的底物特异性，可以优先水解饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，最后水解多不饱和脂肪酸，从而使dha和epa富集于甘油酯，改方法反应条件温和，可获得较高品质的油脂。本案中，脂肪酶优选皱褶假丝酵母脂肪酶。
54.取皱褶假丝酵母脂肪酶加入磷酸盐溶液(0.1mol/l，ph＝6)中，再与粗油脂按照2：1比例混合均匀，此时皱褶假丝酵母脂肪酶添加量为400u/g(以粗油脂质量计)。之后进行充氮密封，置于磁力搅拌水浴锅中，在40℃温度下反应4h。水解完成后，在水解产物中加入氢氧化钠-乙醇溶液(0.5mol/l)调节ph至9.5，再加入正己烷搅拌均匀，静置分层后取上层有机相，经过多次水洗至中性后，加入无水硫酸钠去除水分，在35℃温度下旋转蒸发有机溶剂，即得鳗鱼脂质提取物。酶法富集可以执行多次，以提高dha和epa的含量。
55.基于同一发明构思，本发明还公开了一种甘油酯型鳗鱼脂质提取物，其通过上述的提取工艺制备得到，以及上述工艺制备得到的甘油酯型鳗鱼脂质提取物在降血脂药物中的应用。
56.为了验证本发明提取工艺的有效性、效果，以及脂质提取物的应用效果，分别从粗油脂的得率、酶法富集后dha与epa的含量、鳗鱼脂质提取物对活体的影响这几个方面进行试验研究，具体如下：
57.一、粗油脂的得率试验
58.筛选萃取压力、温度和时间为主要因素，以粗油脂的得率(得率＝提取物质量/原料质量
×
100％)为主要指标，确定超临界萃取海鳗内脏的最佳试验条件，各因素水平见表1。试验共设置了9组，各组变量及结果见表2。
59.表1因素水平表
60.水平压力(mpa)温度(℃)时间(h)122301225402328503
61.表2萃取压力、温度和时间的正交试验结果表
[0062][0063]
表2中，k1值是在每个因素下对应水平为1的得率的平均值，k2值是在每个因素下对应水平为2的得率的平均值，k3值是在每个因素下对应水平为3的得率的平均值，r值是每个因素下k的最大值减最小值。从表2可以看出，影响得率的主次顺序依次是压力、温度和时间；最优工艺条件是：萃取压力为25mpa，萃取温度为40℃，萃取时间为3h。
[0064]
二、酶法富集后鳗鱼脂质提取物中dha与epa的含量试验
[0065]
按照国标gb 5009.168-2016测定鳗鱼脂质提取物中不饱和脂肪酸的含量，同样地，对海鳗内脏为原料提取的鳗鱼脂质提取物进行测定，测定结果见表3。
[0066]
表3粗油脂富集前后脂肪酸的含量表
[0067][0068][0069]
从表2可以看出，经超临界萃取制备的海鳗粗油脂中，不饱和脂肪酸占总脂肪酸的57.2％，其中dha+epa含量为15％。经皱褶假丝酵母脂肪酶催化富集后，鳗鱼油中多元不饱和脂肪酸含量提高，dha+epa含量提高22.39％。经过二次富集，富集后dha+epa含量可达31％。
[0070]
三、鳗鱼脂质提取物对斑马鱼的影响试验
[0071]
本试验均采用海鳗内脏提取的脂质提取物。
[0072]
1、鳗鱼脂质提取物功效浓度试验
[0073]
随机选取5dpf(年龄为受精后5天)黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于烧杯中，烧杯容量为25ml，每烧杯均处理30尾斑马鱼。每一烧杯为一个实验组，共计7个试验组，包括正常对照组、模型对照组、以及5个试验组(5个实验组水溶给与鳗鱼脂质提取物，浓度分别为62.5μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml)。除正常对照组外，
其余各实验组均水溶给予高糖高脂饲料，建立斑马鱼高糖高脂模型。样品处理期间，每天统计各实验组的斑马鱼死亡数量并及时移除。28℃处理48h后，测定鳗鱼脂质提取物对高糖高脂模型斑马鱼的mtc。结果参见表4，各试验组的斑马鱼均无死亡，且表型未见显著差异，鳗鱼脂质提取物功效最大检测浓度(mtc)为1000μg/ml。
[0074]
表4实验体功效浓度试验结果汇总表
[0075][0076][0077]
2、鳗鱼脂质提取物对斑马鱼降甘油三酯功效的试验
[0078]
随机选取5dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于烧杯(25ml)中，每烧杯30尾。每一烧杯为一个实验组，共计6个试验组，包括正常对照组、模型对照组、阳性对照组(给予阿托伐他汀钙，浓度为11.6μg/ml)以及3个试验组(3个实验组水溶给与鳗鱼脂质提取物，浓度分别为250μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml)。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高脂饲料，建立斑马鱼高血脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)。28℃处理48h后，给予油红o进行整体脂肪染色。染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，用image-j高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管染色强度，以该指标的统计学分析结果评价鳗油降甘油三酯功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p＜0.05表明差异具有统计学意义。试验结果参见表5，随着鳗鱼脂质提取物浓度的升高，斑马鱼尾部静脉甘油三酯含量逐渐降低，其中500、1000μg/ml浓度的鳗鱼脂质提取物相对于模型对照组具有显著差异，参见图1～7。
[0079]
表5实验体降甘油三酯功效试验结果汇总表
[0080][0081][0082]
注：与模型对照组比较，标注***表示p＜0.001。
[0083]
3、鳗鱼脂质提取物对斑马鱼降胆固醇功效的试验
[0084]
随机选取5dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于烧杯(25ml)中，每烧杯30尾。每一烧杯为一个实验组，共计6个试验组，包括正常对照组、模型对照组、阳性对照组(给予阿托伐他汀钙，浓度为11.6μg/ml)以及3个试验组(3个实验组水溶给与鳗鱼脂质提取物，浓度分别为250μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml)。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高脂饲料，建立斑马鱼高血脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)。28℃处理32h后，注射胆固醇探针。继续处理16h，每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光显微镜下拍照，用nis-elements d 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼尾部血管胆固醇荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价鳗油降胆固醇功效。统计学处理结果采用mean
±
se表示。用spss26.0软件进行统计学分析，p小于0.05表明差异具有统计学意义。试验结果见参见表6，可以看出随着鳗鱼脂质提取物浓度的升高，斑马鱼尾部血管胆固醇含量逐渐降低，其中500、1000μg/ml的鳗油相对于模型对照组具有显著差异，参见图8～14。
[0085]
表6试验体降胆固醇功效试验结果汇总表
[0086][0087]
注：与模型对照组比较，标注*表示p＜0.05，标注**表示p＜0.01，标注***表示p＜0.001。
[0088]
4、鳗鱼脂质提取物对斑马鱼改善血管壁厚度功效的试验
[0089]
随机选取5dpf黑色素等位基因突变型半透明albino品系斑马鱼于烧杯(25ml)中，每烧杯30尾。每一烧杯为一个实验组，共计6个试验组，包括正常对照组、模型对照组、阳性对照组(给予阿托伐他汀钙，浓度为11.6μg/ml)以及3个试验组(3个实验组水溶给与鳗鱼脂质提取物，浓度分别为250μg/ml、500μg/ml及1000μg/ml)。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高脂饲料，建立斑马鱼高血脂模型。样品与高脂饲料共同处理15h(每天共同处理7.5h)。28℃处理48h后，每个实验组随机选取3尾斑马鱼置于激光共聚焦显微镜下拍照，以斑马鱼眼部血管壁厚度定性评价鳗油改善血管壁厚度功效。结果参见图15～20，可见模型对照组斑马鱼血管壁增厚，提示模型建立成功；鳗鱼脂质提取物250、500和1000μg/ml浓度组血管壁厚度较模型对照组明显降低，提示鳗油具有改善血管壁厚度功效。
[0090]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。